1,透析袋濃縮法
利用透析袋濃縮蛋白質(zhì)溶液是應(yīng)用最廣的一種。將要濃縮的蛋白溶液放入透析袋(無透析袋可用玻璃紙代替),結(jié)扎,把高分子(6000-12000)聚合物如聚乙二醇(碳蠟)、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可將吸水劑配成30%-40%濃度的溶液,將裝有蛋白液的透析袋放入即可。吸水劑用過后,可放入溫箱中烘干或自然干燥后,仍可再用。涪陵濃縮蛋白設(shè)備
主要用于更換蛋白質(zhì)的緩沖液,有透析袋即可,不需要特殊的儀器。
2,冷凍干燥濃縮法
這是濃縮蛋白質(zhì)的一種較好的辦法,它既使蛋白質(zhì)不易變性,又保持蛋白質(zhì)中固有的成分。它是在冰凍狀態(tài)下直接升華去除水分。具體做法是將蛋白液在低溫下冰凍,然后移置干燥器內(nèi)(干燥器內(nèi)裝有干燥劑,如NaOH、CaCl2和硅膠等)。密閉,迅速抽空,并維持在抽空狀態(tài)。數(shù)小時(shí)后即可獲得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白質(zhì)保存方便,應(yīng)用時(shí)可配成任意濃度使用。也可采用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。
在冷凍狀態(tài)下讓揚(yáng)品種的液體升華。
3,吹干濃縮法
將蛋白溶液裝入透析袋內(nèi),放在電風(fēng)扇下吹。此法簡單,但速度慢,且溫度不能過高,更好不要超過15℃。
4,超濾膜濃縮法
此法是利用微孔纖維素膜通過高壓將水分濾出,而蛋白質(zhì)存留于膜上達(dá)到濃縮目的。有兩種方法進(jìn)行濃縮:一種是用醋酸纖維素膜裝入高壓過濾器內(nèi),在不斷攪拌之下過濾;另一種是將蛋白液裝入透析袋內(nèi)置于真空干燥器的通風(fēng)口上,負(fù)壓抽氣,而使袋內(nèi)液體滲出。
主要針對小體積蛋白質(zhì)溶液(幾ml)此法更不易引起變性,不過得有濃縮器,不是哪個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有的。
5,凝膠濃縮法
選用孔徑較小的凝膠,如SephadexG25或G50,將凝膠直接加入蛋白溶液中。根據(jù)干膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數(shù)而稱取所需的干膠量。放入冰箱內(nèi),凝膠粒子吸水后,通過離心除去。
6,濃縮膠濃縮法
濃縮膠是一種高分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)聚合物,具有很強(qiáng)的吸水性能。每克干膠可吸水120ml~150ml。它能吸收低分子量的物質(zhì),如水、葡萄糖、蔗糖、無機(jī)鹽等,適宜濃縮10000分子量以上的生物大分子物質(zhì)。濃縮后,蛋白質(zhì)的回收率可達(dá)80%~90%。比凝膠應(yīng)用方便,直接加入被濃縮的溶液中即可。必須注意,濃縮溶液的pH值應(yīng)大于被濃縮物質(zhì)的等電點(diǎn),否則在濃縮膠表面產(chǎn)生陽離子交換,影響濃縮物質(zhì)的回收率。
7,丙酮沉淀法:
試驗(yàn)要求的儀器簡單,但是常常導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。
8,免疫沉淀法:
通過免疫沉淀法,用蛋白質(zhì)特異性能夠定量能夠分離目的蛋白。有三個(gè)步驟組成:首先將特異性抗體加入細(xì)胞提取物,第二步加入經(jīng)化學(xué)固定的金黃色葡萄球菌,以確保形成大量沉淀。這些細(xì)菌通過蛋白質(zhì)A和抗體形成復(fù)合物,蛋白質(zhì)A與免疫球蛋白的Fc部分有高度的親和性。或者說,純化的蛋白A結(jié)合Sephrarose樹脂,為從細(xì)胞提取物中分離出抗原抗體復(fù)合物,提供一個(gè)固體基質(zhì)。最后通過洗脫,除去尚未沉淀的雜質(zhì)。
為了除去已破碎的或固定差的細(xì)胞,在用于免疫沉淀(作用)之前可以與纖細(xì)地金黃色葡萄球菌細(xì)胞,如果要用蛋白質(zhì)ASephrarose樹脂,參考廠家說明書。
9,硫酸銨沉淀法:
利用高濃度鹽將蛋白質(zhì)析出(鹽析),選擇硫酸按是因?yàn)椋蝴}析有效性,pH范圍廣,溶解度高,溶液散熱少,經(jīng)濟(jì)。
10,(低溫)有機(jī)溶劑沉淀法:
強(qiáng)調(diào)低溫(0-4度以下)是因?yàn)?0度時(shí)蛋白會(huì)在有機(jī)溶劑中變性,可用乙醇,丙酮等。注意:Mg2++離子,pH值。
11,聚乙二醇(PEG)沉淀法:
PEG是一個(gè)水溶性非離子多聚體,使用PEG時(shí)旨在個(gè)別情況下才會(huì)是蛋白質(zhì)稍有變性!他溶解是散熱低,形成沉淀的平衡時(shí)間短,通常達(dá)到30%時(shí)蛋白質(zhì)就會(huì)達(dá)到更大量的沉淀。